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考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度的原理、步骤及注意事项
关键词:紫外分光光度计;蛋白质浓度;美析仪器; UV-1100;UV-1200
蛋白质浓度测定的方法有很多,考马斯亮蓝测定蛋白质是实验室zui常见的一种方式,它利用比色法和色素法混合方法、操作简便,下文介绍了考马斯亮蓝测定蛋白质浓度的原理、优缺点、操作以及注意事项。
实验原理
考马斯亮蓝(Coomassie Brilliant Blue)法测定蛋白质浓度,是利用蛋白质―染料结合的原理,定量的测定微量蛋白浓度的快速、灵敏的方法。这种蛋白质测定法具有超过其他几种方法的突出优点,因而正在得到广泛的应用。这一方法是目前灵敏度zui高的蛋白质测定法。
考马斯亮兰G-250染料,在酸性溶液中与蛋白质结合,使染料的zui大吸收峰(lmax)的位置,由465nm变为 595nm,溶液的颜色也由棕黑色变为兰色。通过测定595nm处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。研究发现,染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸(特别是精氨酸)和芳香族氨基酸残基相结合。
考马斯亮蓝染色法的突出优点是:
(1)灵敏度高,据估计比Lowry法约高四倍,其zui低蛋白质检测量可达1mg。这是因为蛋白质与染料结合后产生的颜色变化很大,蛋白质-染料复合物有更高的消光系数,因而光吸收值随蛋白质浓度的变化比Lowry法要大的多。
(2)测定快速、简便,只需加一种试剂。完成一个样品的测定,只需要5分钟左右。由于染料与蛋白质结合的过程,大约只要2分钟即可完成,其颜色可以在1小时内保持稳定,且在5分钟至20分钟之间,颜色的稳定性。因而*不用像Lowry法那样费时和严格地控制时间。
(3)干扰物质少。如干扰Lowry法的K+、Na+、Mg2+离子、Tris缓冲液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、EDTA等均不干扰此测定法。
此法的缺点是:
(1)由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同,因此考马斯亮蓝染色法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差,在制作标准曲线时通常选用g—球蛋白为标准蛋白质,以减少这方面的偏差。
(2)仍有一些物质干扰此法的测定,主要的干扰物质有:去污剂、 Triton X-100、十二烷基硫酸钠(SDS)等。
试剂与器材
一、试剂
考马斯亮蓝试剂:
考马斯亮蓝G―250 100mg溶于50mL 95%乙醇中,加入100mL 85%磷酸,用蒸馏水稀释至1000mL。
二、标准和待测蛋白质溶液
1.标准蛋白质溶液
结晶牛血清蛋白,预先经微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量,根据其纯度用0.15mol/L NaCl配制成1mg/mL蛋白溶液。
2.待测蛋白质溶液。
人血清,使用前用0.15mol/L NaCl稀释200倍。
叁、器材
试管1.5×15cm(×6),试管架,移液管管0.5mL(×2);1mL(×2);5mL(×1);恒温水浴;分光光度计,美析UV-1100;UV-1200。
操作方法
一、制作标准曲线
取7支试管,按下表平行操作。
试管编号 0 1 2 3 4 5 6
标准蛋白溶液(mL) 0 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06
0.1 0.09 0.08 0.07 0.06 0.05 0.04
考马斯亮蓝试剂(mL) 5mL
摇匀,1丑内以0号管为空白对照,在595苍尘处比色
A595nm
绘制标准曲线:以础595苍尘为纵坐标,标准蛋白含量为横坐标,在坐标纸上绘制标准曲线。
二、未知样品蛋白质浓度测定
测定方法同上,取合适的未知样品体积,使其测定值在标准曲线的直线范围内。根据所测定的A595nm值,在标准曲线上查出其相当于标准蛋白的量,从而计算出未知样品的蛋白质浓度(mg/mL)。
注意事项
在试剂加入后的5-20min内测定光吸收,因为在这段时间内颜色是zui稳定的。
测定中,蛋白-染料复合物会有少部分吸附于比色杯壁上,测定完后可用乙醇将蓝色的比色杯洗干净。
利用考马斯亮蓝法分析蛋白必须要掌握好分光光度计的正确使用,重复测定吸光度时,比色杯一定要冲洗干净,制作蛋白标准曲线的时候,蛋白标准品是从低浓度到高浓度测定,防止误差。
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